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        细胞生长与增殖
        点击次数:44 发布时间:2022-03-30

        培养细胞的生存环境是培养瓶、器皿或其他容器,生存空间及营养有限,当细胞增殖到一定密度后,分离出一部分细胞和更新营养液,使细胞更好地生存,这一过程称之为“传代"(passage或subculture)。

        值得注意的是:每次传代细胞在生长和增殖方面受到一定的影响。

        (一)细胞生命期(life span of culture cells)

        指细胞在培养过程中持续增殖和生长的时间。一般根据细胞种类、性状和原供体的年龄的情况而定。

        例如:二倍体成纤维细胞,在不冻存和反复传代条件下可传30~50代,相当于150~300个细胞增殖周期,能维持一年左右的生命,细胞便开始凋亡(apoptosis)。

        细胞在生存过程中经历以下三个阶段

        1.原代培养期(primary culture)

        组织到第一次传代 时间大约为1~4周

        特点:细胞活跃移动,分裂,但不旺盛多呈二倍体核型。

        原代与体内原组织形态结构和功能活动基本相似。

        各细胞的遗传性状互不相关,细胞相互依存性强,如果把这种稀释分散成单细胞,在软琼脂培养基中进行培养细胞克隆的形成率(cloning efficiency)下降,表明细胞独立生存性差。

        2.传代期(passage)

        初代培养细胞一经传代便称之为细胞系(cell line)

        特点:细胞增殖旺盛,并维持二倍体核型,也叫二倍体细胞系(diploid cell line)为了保存二倍体细胞性质,细胞应在初代或传代早期冻存为好。

        一般细胞在10代以内冻存。

        冻存配方:

        向培养液加入保护剂二甲基亚砜(DMSO)或甘油,封入安瓶中。

        存于在液氮中温度可达到-196℃,可长期储存。如解冻后细胞复苏,仍能继续增殖生长,细胞性状不受影响,成为保存细胞最主要的手段。

        3.衰退期

        特点:细胞仍生存—增殖减慢—不增殖—轮廓增强—衰退凋亡

        注意:细胞在三期中的任何一期(一般发生在传代后期或衰退期)在某些因素影响下,如血清质量不佳、病毒污染、温度和pH不稳等,细胞可能发生自发转化(spontaneous transformation);

        细胞可能获得永生性(immortality) 或称为恶性 (malignancy)。细胞获得持久性的增殖能力,这样的细胞群体称为连续细胞系(continuous cell line)。当细胞获得不死性后,细胞核型大多变成异倍体(heteroploid)接触抑制消失。

        (二)培养细胞一代生存期

        “ 一代"指细胞接种到分离再培养的所用的时间。与细胞倍增一代不是一个含义。在细胞一代中,细胞能倍增3~6次,经历三个阶段:

        贴附现象是复杂和受多种因素的影响。

        细胞不贴附:底物表面不干净,影响细胞贴附。

        利于细胞贴附:底物表面带有阳性物质与特殊物质: 纤粘连蛋白(fibronectin FN)、细胞表面蛋白(cell surface protein CSP)

        这些物质有的存在与细胞表面,有的来自血清。

        1.潜伏期(latent phase) :

        接种 经过悬浮期(细胞质回缩,胞体呈圆球形)贴壁。

        初代培养细胞经过 10~24小时或更多时间。

        连续细胞系和癌细胞系经过10~30分钟贴附。

        潜伏期特点:

        长短与细胞接种密度、种类、使用的培养基性质有关。

        (1)细胞贴附后进入潜伏期,细胞无增殖。少见分裂相,细胞有运动活动。

        (2)初代培养 细胞潜伏期约为24~96小时或更长,连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期约6~24小时。

        (3)细胞接种密度大潜伏期短。

        (4)细胞出现分裂相增多时,标志细胞进入指数增生期。

        2.指数增生期(logarithmic growth phase):

        特点:细胞增殖最旺盛阶段,分裂相增多,细胞分裂指数(mitotie index MI) :表示每1000个细胞中的分裂相数。

        条件:分裂相数与细胞种类、培养成分、pH培养箱温度有关。

        细胞分裂指数:

        初代细胞:在0.1%~0.5%之间% ,

        连续分裂细胞和肿瘤细胞:3 ~5%。

        指数增生期是作为细胞一代活力很好的时期,是进行实验最好和最主要的阶段。

        指数增生期持续3~5天,细胞数量增多后生长空间变小,细胞相互接触可连接成片。

        正常细胞:细胞相互接触能抑制细胞运动,这种现象称为接触抑制(contact inhibition)。

        肿瘤细胞:没有这种现象,可作为区别正常与肿瘤细胞的标志之一。当肿瘤细胞达到一定密度后向三维空间发展,使细胞发生堆积(piled up)。

        由于细胞不断增殖分裂,细胞数量持续增多,培养液的营养成分减少,代谢产物增多,细胞受营养的枯竭和代谢物的影响,则发生密度抑制(Density inhibition),导致细胞分裂停止。

        3.停滞期(stagnate phase)

        细胞量和密度达到饱和,细胞停滞增殖。表明细胞进入到停滞期,细胞数量持平,也称为平顶期(plateau)。

        特点:细胞不增殖,有代谢活动。培养液中的营养已逐渐耗尽,代谢产物积累增多,pH降低,此时需要传代,否则细胞将会中毒,发生形态改变,细胞会从底物脱落死亡。

        注意:传代过晚将影响下一代细胞的生长,至少要再传 1~2代 。

        通过换液淘汰死细胞和受损较轻的细胞。待细胞全部恢复后再用。在这一点上操作时一定要特别注意。

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